目錄生物化學(xué)影響因子 亞太生物學(xué)期刊影響因子 影響因子5左右的腫瘤雜志 光化學(xué)與光生物學(xué)雜志影響因子 生物學(xué)教學(xué)影響因子
期刊：Cell Reports；影響因子：8.109
發(fā)表單位：約翰霍普金斯大學(xué)等
高級(jí)漿液性卵巢癌（HGSC）是導(dǎo)致大多數(shù)與卵巢癌相關(guān)的死亡的最常見和致命的卵巢癌類型，了解卵巢癌發(fā)生、發(fā)展和治療敏感性的分子機(jī)制是進(jìn)一步提高患者生存率的關(guān)鍵步驟。先前已有大規(guī)模的組學(xué)研究中對(duì)腫瘤組織進(jìn)行了廣泛的分析，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組以及表觀修飾等，然而對(duì)于蛋白質(zhì)翻譯修飾而言，除磷酸化外，尚未在大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究中研究其他蛋白質(zhì)修飾。糖基化在癌癥發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，例如細(xì)胞間粘附、細(xì)胞生長、配體-受體結(jié)合和腫瘤轉(zhuǎn)移。與其他蛋白質(zhì)修飾相比，糖蛋白的分析由于糖蛋白結(jié)構(gòu)的巨大復(fù)雜性和異質(zhì)性而受到限制。糖蛋白組學(xué)技術(shù)的最新進(jìn)展已使復(fù)雜糖蛋白的全面分析成為可能。
2020年10月發(fā)表在《Cell Reports》的一項(xiàng)研究中，利用蛋白質(zhì)組學(xué)和N-鏈接糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，地分析了83例HGSC患者腫瘤組織及23例健康輸卵管組織標(biāo)本。研究提供了HGSC完整的蛋白組學(xué)和糖蛋白組學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)腫瘤中的糖蛋白在多個(gè)水平上受到調(diào)節(jié)，包括糖蛋白豐度、確定的特定糖位處糖基化的總體程度以及糖位處糖基化的類型，并揭示了以前從未研究過的蛋白質(zhì)糖基化在卵巢癌中的潛在功能。
由于一系列修飾，許多基因產(chǎn)物表現(xiàn)出極大的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性。這些修飾不是直接編碼在基因組模板中，但往往影響蛋白質(zhì)的功能。蛋白質(zhì)糖基化在蛋白質(zhì)正常功能中起著至關(guān)重要的作用。但是，與其他蛋白質(zhì)修飾（例如磷酸化）相比，糖蛋白的分析具有挑戰(zhàn)性。本研究對(duì)83個(gè)前瞻性收集的高級(jí)漿液性卵巢癌（HGSC）和23個(gè)非腫瘤組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白組學(xué)的綜合分析，揭示了腫瘤特異性糖基化以及與三個(gè)腫瘤簇相關(guān)的不同糖基化，并鑒定了與糖基化改變相關(guān)的糖基化酶。
83個(gè)卵巢癌和23個(gè)相關(guān)非腫瘤組織的蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白組學(xué)；
糖基化與3個(gè)腫瘤簇相關(guān)；
糖蛋白和糖位的腫瘤特異性變化顯而易見；
確定負(fù)責(zé)糖基化改變余汪的酶。
收集了83例未經(jīng)治療的HGSC腫瘤和23例非腫瘤組織，用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)和N-連接糖蛋白組分析?？偣茶b定出8144種蛋白質(zhì)，其中1690個(gè)含N-連接糖基的肽。根據(jù)已鑒定的N聯(lián)聚糖的單糖組成，定義了三種聚糖類型：低聚甘露糖/高甘露糖（HM），含有兩個(gè)N-乙?；禾前罚∟）和己糖（H）而沒有另外的巖藻糖（F）或唾液酸（S）的聚糖；唾液酸化聚糖（Sia），代表任何含有S的聚糖；以及巖藻糖基化聚糖（Fuc），代表任何已鑒定的含有F的聚糖。
為了研究HGSC的迅毀橡癌癥異質(zhì)性，作者使用糖蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，鑒定了3種糖肽簇（IGP1-3）。通過計(jì)算了IGP簇與臨床表型的相關(guān)性，IGP3與腫瘤細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，與網(wǎng)膜的解剖部位呈負(fù)相關(guān)。功能分析顯示，IGP1富含溶酶體，IGP2中富含磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信號(hào)通路、粘著斑和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）-受體相互作用，IGP3富含補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)。結(jié)果還顯示了與IGP簇相關(guān)的聚糖，包括IGP1中的HM聚糖，IGP2中的HM和Fuc聚糖，IGP3中的Fuc和Sia聚糖。
先前研究已報(bào)道，IGP腫瘤簇與分化、免疫反應(yīng)、間充質(zhì)和增生等4種亞型有關(guān)。作者進(jìn)一步探索本研究中IGP腫瘤簇與腫瘤亞型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)性亞型的特征蛋白在IGP簇1中升高，間充質(zhì)的特征蛋白在IGP2中降低而在IGP3中升高，這表明IGP1與免疫反應(yīng)性亞型有關(guān)，而IGP3與間充質(zhì)亞型有關(guān)。通過評(píng)估基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞對(duì)聚類結(jié)果的影響，IGP1簇似乎不受腫瘤純度或基質(zhì)評(píng)分的影響，IGP2具有相對(duì)較高的腫瘤純度和較低的基質(zhì)和免疫評(píng)分，IGP3具有較低的腫瘤純度和較高的基質(zhì)和免疫評(píng)分。
蛋白糖基化水平的主成分分析（PCA）顯示，腫瘤和非腫瘤樣本存在明顯界限。與非腫瘤樣品相比，在腫瘤中48個(gè)糖肽顯著上調(diào)，而94個(gè)糖肽顯著下調(diào)。為了尋找對(duì)卵巢癌診斷的可能有用的差異糖蛋白，作者使用受試者工作特性曲線評(píng)估了糖肽特征，顯示HYOU1、FKBP10、PSAP和PPT1能夠?qū)δ[瘤和非腫瘤組織進(jìn)行良好分類。功能分析顯示，溶酶體是腫瘤畝旁樣品中顯著上調(diào)的糖肽富集的通路，而補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、ECM-受體相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路、局灶性在腫瘤樣品中被下調(diào)糖肽富集。比較腫瘤樣品和非腫瘤樣品之間糖肽的相對(duì)豐度，觀察到帶有HM型聚糖的糖肽在腫瘤中具有更高豐度，而含有Fuc和Sia的糖肽在腫瘤中豐度低。含HM、Fuc或Sia的糖肽涉及的途徑表明，溶酶體途徑是含HM的糖肽中最富集的途徑，Euc糖肽富集ECM-受體相互作用，Sia糖肽富集凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
比較腫瘤和非腫瘤樣品中蛋白糖基化和蛋白表達(dá)，糖基化位點(diǎn)和糖蛋白在腫瘤中顯示出不同的調(diào)節(jié)水平，糖蛋白可能受糖基化占有率以及整體蛋白表達(dá)的調(diào)控。盡管含糖基肽的大多數(shù)差異豐度變化仍與相應(yīng)的整體蛋白表達(dá)正相關(guān)，但某些糖蛋白糖基的豐度變化可能顯示出與其全局水平不同的表達(dá)模式。例如，卵巢癌的生物標(biāo)志物之一MCU16，在HGSC和健康輸卵管中蛋白表達(dá)量相近，但其兩個(gè)糖修飾位點(diǎn)MUC16_12272和MCU16_12586的糖基化修飾水平則在HGSC中明顯升高，這表明簡單地測量蛋白質(zhì)豐度和隨后的基于蛋白質(zhì)的聚類可能不足以全面了解腫瘤生物學(xué)。與非腫瘤相比，腫瘤中糖肽的豐度變化不僅受每個(gè)糖位處的糖基化反應(yīng)程度的調(diào)節(jié)，也受到修飾糖位的聚糖的影響。含HM聚糖的糖肽在腫瘤中大多過表達(dá)，而含其他類型含聚糖的糖肽的豐度變化則各不相同，并觀察到在相同糖位上糖基化的異質(zhì)性。
為了研究聚糖表達(dá)的調(diào)節(jié)，作者將糖肽數(shù)據(jù)集中每個(gè)腫瘤和非腫瘤樣品中糖肽的豐度與從蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集中確定和量化的糖基化酶的蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行了關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)具有HM聚糖糖基化的糖肽與糖苷酶2亞基β（PRKCSH）的表達(dá)呈正相關(guān)。同時(shí)，在所有已識(shí)別的糖基化酶中只有PRKCSH被發(fā)現(xiàn)在腫瘤中顯著上調(diào)，經(jīng)HM聚糖修飾的糖肽在腫瘤樣品中增加。
為了確定HM修飾對(duì)糖蛋白的潛在作用，作者分析了部分糖基化生物合成途徑以合成具有關(guān)鍵糖基化酶功能的HM。腫瘤細(xì)胞中PRKCSH表達(dá)的增加可能導(dǎo)致具有HM糖基化的糖蛋白升高，從而阻止了進(jìn)一步詳細(xì)的復(fù)雜碳水化合物合成。HM聚糖修飾的這種增加對(duì)于為腫瘤生長大量合成的糖蛋白可能至關(guān)重要，對(duì)癌細(xì)胞中被HM修飾的糖蛋白網(wǎng)絡(luò)的研究可能有助于鑒定快速細(xì)胞生長所需的糖蛋白。通過蛋白網(wǎng)絡(luò)分析，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤中上調(diào)的HM糖蛋白質(zhì)參與了一個(gè)主要與溶酶體、膠原代謝過程和內(nèi)膜有關(guān)的網(wǎng)絡(luò)。總之，通過分析由HM聚糖修飾的糖肽，該研究確定了糖蛋白是癌癥發(fā)展所需的潛在靶標(biāo)。
在這項(xiàng)研究中，綜合的多組學(xué)分析，包括HGSC的蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白組學(xué)分析，證明了糖基化與卵巢癌的聯(lián)系。通過應(yīng)用多組學(xué)數(shù)據(jù)在腫瘤和非腫瘤之間的差異表達(dá)，鑒定了幾種潛在的腫瘤特異性蛋白，糖蛋白和聚糖。進(jìn)一步的研究表明，腫瘤中糖蛋白表達(dá)的差異可以表現(xiàn)為糖位處糖基化程度的差異以及糖位上聚糖的類型。腫瘤的糖基化生物合成途徑不同于非腫瘤，由于PRKCSH的上調(diào)，N-連接的糖蛋白在腫瘤中可以攜帶更多的HM聚糖，這可能是PRKCSH調(diào)節(jié)腫瘤中有效糖蛋白產(chǎn)生、抗環(huán)境壓力和溶酶體過度活化的常見機(jī)制?？傊?，HGSC腫瘤樣品的綜合蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)測量提供了寶貴的公共資源，將糖蛋白與其糖基化程度、聚糖修飾和糖基化酶聯(lián)系起來的糖蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)將改善未來對(duì)卵巢癌分子基礎(chǔ)的了解。
腫瘤生物消毀學(xué)指研究腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制，以及腫瘤防治的生物科學(xué)：地介紹腫瘤細(xì)或改胞的衫橋判結(jié)構(gòu)性改變以及由此產(chǎn)生的功能改變，及腫瘤的一般生物學(xué)特點(diǎn)，另外包括腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)、腫瘤的防治及相關(guān)知識(shí)等。
A Tuft Cell-Like Signature Is Highly Prevalent in Thymic Squamous Cell Carcinoma and Delineates New Molecular Subsets Among the Major Lung Cancer Histotypes
胸腺鱗狀細(xì)胞癌中高度流行一種類似于Tuft細(xì)胞的特征，并在主要的肺癌組織型中劃分出新的分子亞型
發(fā)表期刊：J THORAC ONCOL
發(fā)表日期：2021 Feb 17
影響因子：13.357
DOI:10.1016/j.jtho.2021.02.008
一、研究背景
胸腺上皮瘤（TETs）包括胸腺瘤和侵襲性較強(qiáng)的胸腺昌梁癌（TCs）。胸腺瘤根據(jù)新生上皮細(xì)胞的組織形態(tài)和未成熟T細(xì)胞的比例，可分為A型、AB型、B1型、B2型、B3型和其他罕見類型。TCs的分化程度不一，但胸腺鱗狀細(xì)胞癌（TSQCCs）約占80%的病例。由于它們的罕見性和代表性細(xì)胞系的匱乏，現(xiàn)階段對(duì)TETs的生物學(xué)認(rèn)識(shí)不足。手術(shù)以外的治療仍然主要是經(jīng)驗(yàn)性的，有效的長期治療方案螞鉛是不可用的。
二、材料與方法
1數(shù)據(jù)來源
1）TCGA：胸腺瘤（也包括TC）（N = 117，包括A型(N = 10)、AB型(N = 48)、B1型(N = 12)、B2型(N = 25)、B3型(N = 10)、微結(jié)節(jié)胸腺瘤(N = 2)和TCs(N = 10)），肺SQCC和肺腺癌。
2）GSE57892：包含22例TETs型A(N = 5)、AB(N = 2)、B2(N = 3)和B3胸腺瘤(N = 5)和TC(N = 7)
3）George等人提供的66例肺LCNECs
4）RT-qPCR：60個(gè)速凍的TETs病例
5）免疫組化的分析：該隊(duì)列包括胸腺瘤、胸腺和非胸腺SQCCs以及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（NENs）
2分析流程
1）RT-qPCR、IHC、Western Blotting
2）統(tǒng)計(jì)分析：Wilcoxon檢驗(yàn)、Student's t檢驗(yàn)、chi-square檢驗(yàn)、Fisher's exact檢驗(yàn)、無監(jiān)督聚類、富集分析、生存分析
3）胸腺濾泡細(xì)胞耐物運(yùn)表達(dá)試劑盒：根據(jù)最近發(fā)表的小鼠胸腺上皮細(xì)胞（TEC）亞集（GSE114651）的基因表達(dá)標(biāo)志，16 KIT，人TC標(biāo)記的小鼠同源物KIT的mRNA表達(dá)水平在小鼠胸腺Tuft細(xì)胞中高于其他mTEC亞集和皮質(zhì)TECs。這一發(fā)現(xiàn)促使作者調(diào)查已發(fā)表的人類胸腺瘤和TCs的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，以獲得Tuft細(xì)胞標(biāo)記物。
三、結(jié)果展示
01 -TCs在mRNA水平上表達(dá)胸腺濾泡細(xì)胞相關(guān)基因
搜索TCGA 數(shù)據(jù)集的胸腺瘤和TCs的24個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平，這些基因在正常的小鼠胸腺Tuft細(xì)胞中特征性地表達(dá)，但不在其他正常TEC亞集，作者發(fā)現(xiàn)TCs經(jīng)常表達(dá)這些基因。
POU2F3，Tuft細(xì)胞的主調(diào)節(jié)器，和ALOX5，GFI1B，CHAT和L1CAM的表達(dá)水平顯著高于TCs比A型（CHAT除外），AB和B1-3胸腺瘤（圖1）。通常局限于正常皮質(zhì)TEC和非tuft細(xì)胞mTEC亞群15的基因在TC中的表達(dá)與胸腺瘤相比沒有顯著升高（補(bǔ)充圖3A）。在Petrini等人提供的獨(dú)立TET數(shù)據(jù)集中也觀察到TC中Tuft細(xì)胞標(biāo)志物的上調(diào)（補(bǔ)充圖3B）。最后，在60個(gè)速凍TET隊(duì)列中，RT-qPCR分析證實(shí)，兩個(gè)關(guān)鍵的Tuft細(xì)胞標(biāo)志物POU2F3和GFI1B的表達(dá)水平在TCs中顯著高于A型、AB型、B1型、B2型和B3型胸腺瘤（圖2A）。
02 -TSQCCs普遍表達(dá)關(guān)鍵的Tuft細(xì)胞蛋白，POU2F3和GFI1B
124例福爾馬林固定、石蠟包埋的TET（包括上述速凍病例中的部分（60例中的7例））的IHC顯示，雖然陽性細(xì)胞的比例不一（圖2C），但幾乎所有的胸腺瘤和胸腺NENs都是陰性的，但約70%的TSQCC中都有POU2F3蛋白表達(dá)（圖2B）。同樣，GFI1B的表達(dá)在TSQCC和其他TET亞型之間有顯著差異，但GFI1B陽性TSQCC的比例低于POU2F3陽性TSQCC。POU2F3和GFI1B的IHC也成功標(biāo)記了胰腺中的正常Tuft細(xì)胞。
與TSQCC相反，來自其他器官的SQCCs和NENs通過IHC呈POU2F3陰性。值得關(guān)注的是，皮膚SQCCs也是POU2F3陰性，盡管POU2F3在正常角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)（圖2B）。
03 -Tuft細(xì)胞樣和非Tuft細(xì)胞樣的TSQCCs代表不同的子集
作者的TSQCC病例中共有30%，TCGA聯(lián)盟和Petrini等的隊(duì)列中也有類似數(shù)量的病例表現(xiàn)出非Tuft細(xì)胞樣表型（圖3A和補(bǔ)充圖3B）。對(duì)所有胸腺瘤和TSQCC的全局基因表達(dá)譜進(jìn)行分層聚類，發(fā)現(xiàn)所有的Tuft細(xì)胞樣TC都聚成一個(gè)組，雖然非Tuft細(xì)胞樣TC分散在胸腺瘤中（圖3B）。在驅(qū)動(dòng)基因突變和臨床發(fā)現(xiàn)方面，兩組的規(guī)模太小，無法得出有意義的結(jié)論（補(bǔ)充圖5A和B）。相比之下，TC中最常見的染色體異常--16q的丟失，在所有的Tuft細(xì)胞樣TC中觀察到，但在TCGA和Petrini等的聯(lián)合隊(duì)列中的非Tuft細(xì)胞樣TC中都沒有（圖3A和補(bǔ)充圖5D）。
04 -TC的Tuft細(xì)胞樣表型與KIT的表達(dá)密切相關(guān)
比較POU2F3和GFI1B的mRNA表達(dá)水平和TSQCCs的經(jīng)典診斷標(biāo)記基因、KIT和CD5，在作者和Petrini等的隊(duì)列中，這兩個(gè)Tuft生細(xì)胞標(biāo)記物與KIT和CD5的水平有中等至強(qiáng)的相關(guān)性，但在TCGA數(shù)據(jù)集中的相關(guān)性較低。此外，在TCGA和Petrini等以及作者的隊(duì)列中，Tuft細(xì)胞標(biāo)志物和KIT表達(dá)的相關(guān)性始終很高，且強(qiáng)于Tuft細(xì)胞標(biāo)志物和CD5之間的相關(guān)性（補(bǔ)充圖5C、5E和6A）。
在蛋白質(zhì)水平上，從免疫組化隊(duì)列中隨機(jī)選擇的24個(gè)TSQCC中，有12個(gè)共表達(dá)POU2F3、KIT和CD5，所有POU2F3陽性的病例(N＝17)均表達(dá)KIT，盡管12個(gè)也是CD5陽性(補(bǔ)充圖6B和C)?？傊?，KIT的表達(dá)與TCs的Tuft細(xì)胞樣表型的相關(guān)性比CD5的表達(dá)更強(qiáng)。
05 -一種類似于Tuft細(xì)胞的特征和KIT的表達(dá)表征了NSCLC的子集
接下來對(duì)肺癌的TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尋找簇細(xì)胞樣mRNA信號(hào)。在TET結(jié)果的基礎(chǔ)上，經(jīng)驗(yàn)性地定義簇細(xì)胞樣腫瘤為POU2F3和GFI1B的mRNA表達(dá)z得分均大于2（因此稱為POU2F3和GFI1B共表達(dá)者）。
來自TCGA隊(duì)列的484個(gè)肺SQCCs中，共有9個(gè)是POU2F3和GFI1B共表達(dá)者，這個(gè)子集不僅發(fā)現(xiàn)其他Tuft細(xì)胞標(biāo)志物上調(diào)，而且還發(fā)現(xiàn)KIT上調(diào)（圖4A和補(bǔ)充圖7A）。對(duì)全局基因表達(dá)譜進(jìn)行分層聚類發(fā)現(xiàn)，9個(gè)簇細(xì)胞樣肺SQCC中的8個(gè)聚成一個(gè)組，表明它們形成了一個(gè)獨(dú)特的亞型（圖4A）。
利用基因本體富集分析，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞核相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，尤其是轉(zhuǎn)錄因子，在叢生細(xì)胞樣肺SQCCs中顯著富集（圖4B），強(qiáng)調(diào)它們在轉(zhuǎn)錄本水平上與非叢生細(xì)胞樣肺SQCCs不同。在基因水平上，RB1失活突變在tuft細(xì)胞樣亞組中顯著更常見，盡管TP53突變在兩個(gè)亞組中同樣分布（圖4C和補(bǔ)充圖7B）。
分析TCGA數(shù)據(jù)集提供的虛擬組織學(xué)切片，簇細(xì)胞樣肺SQCCs的分化普遍比非簇細(xì)胞樣病例差，9例中僅有3例表現(xiàn)為局灶性角化（補(bǔ)充圖7D）。在臨床上，女性和重度吸煙者在tuft細(xì)胞樣肺SQCCs中的比例過高（圖4D）。雖然在TCGA隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)簇細(xì)胞樣肺SQCCs的階段明顯較低，但沒有發(fā)現(xiàn)顯著的生存差異（圖4D和補(bǔ)充圖7D）。
在510個(gè)TCGA肺腺癌中，有3個(gè)是Tuft細(xì)胞樣腫瘤，與它們的SQCC對(duì)應(yīng)物相似，它們表達(dá)KIT，聚集在一起(補(bǔ)充圖7E)，顯示RB1拼接突變或深度缺失以及TP53突變(補(bǔ)充圖7F)，并且在組織學(xué)上分化較差(補(bǔ)充圖7G)。事實(shí)上，在對(duì)合并的肺SQCCs和腺癌的TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行層次聚類分析時(shí)，兩個(gè)隊(duì)列的叢細(xì)胞樣子集聚成一個(gè)組，表明它們的腫瘤生物學(xué)相似（圖4E）。
分析了George等人提供的數(shù)據(jù)集，根據(jù)mRNA表達(dá)的絕對(duì)值確定了12個(gè)POU2F3和GFI1B共表達(dá)者和54個(gè)非簇細(xì)胞樣病例（圖5A）。前者顯著共表達(dá)其他簇細(xì)胞制造者和KIT，12例中有8例在基因表達(dá)分析上聚成一個(gè)小群(圖5A)。與之前對(duì)SCLC的研究一致，19例簇細(xì)胞樣LCNECs不表達(dá)Rudin等提出的其他3個(gè)POU2F3陰性SCLC亞組的主轉(zhuǎn)錄因子，神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物CHGA和SYP的表達(dá)水平明顯低于非簇細(xì)胞樣LCNECs（圖5B）。
與簇細(xì)胞樣肺SQCC和腺癌相似，簇細(xì)胞樣肺LCNEC常有TP53和RB1突變，且RB1突變頻率明顯高于非簇細(xì)胞樣隊(duì)列。此外，LCNEC整體典型的STK11熱點(diǎn)突變，在所有簇細(xì)胞樣LCNEC中都不存在（圖5C）。盡管存在這些分子差異，但兩組之間的臨床特征并無不同（圖5D）。
四、結(jié)論
本研究中，作者報(bào)告了tuft細(xì)胞相關(guān)基因，特別是POU2F3和GFI1B，在大多數(shù)TSQCCs中高表達(dá)。此外，肺鱗狀細(xì)胞癌(SQCC)、腺癌和大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌(LCNECs)等較小的子集也表達(dá)了類似tuft細(xì)胞的特征?？傊?，tuft細(xì)胞樣表型確定了TSQCCs的一個(gè)新的亞組和不同的肺癌類型，具有不同的分子和病理特征。這種特征伴隨著獨(dú)特的臨床、組織學(xué)和遺傳學(xué)特征，表明它在各自的癌癥類型中劃分了生物學(xué)上相關(guān)的子集。
我現(xiàn)在搞清為什么醫(yī)學(xué)期刊影響因子高。影響因子=被引用數(shù)/發(fā)表數(shù)(指兩年內(nèi))，如某期刊上一年文章只被本期刊第二年引用，那么理論渣蠢改上最高影響因子=1，如果某學(xué)科只有一個(gè)期刊，則該學(xué)科影因最多為1。這樣看醫(yī)學(xué)類有檔陪影因30的期刊，說明該學(xué)科同類期刊至少30個(gè)。所以影響因子高只能說明該學(xué)科期刊多并非人氣旺如判。公平的指標(biāo)=影響因子/本學(xué)科期刊總數(shù)。一本期刊ㄧ次刊登100篇文章不如分成10種期刊每種ㄧ次刊登10篇，影響因子立馬增10倍。
An independent poor-prognosis subtype of breast cancer defined by a distinct tumor immune microenvironment
一種由獨(dú)特的腫瘤免疫微環(huán)境定義的獨(dú)立貧血亞型乳腺癌
發(fā)表期刊：Nat Commun
發(fā)表日期：2019 Dec 3
影響因子：12.121
DOI:10.1038/s41467-019-13329-5
一、研究背景
腫瘤微環(huán)境影響癌癥的起始和進(jìn)展。在乳腺癌中，臨床病理特征，如年齡，等級(jí)，階段和分子亞型與預(yù)后有關(guān)，并驅(qū)動(dòng)治療決策。5種臨床相關(guān)的分子亞型：Luminal A、Luminal B、Her2富集型、基底樣型和正常樣型，其發(fā)病率、生存率、預(yù)后和腫瘤生物學(xué)特性各不相同。
除了癌細(xì)胞生物學(xué)因素外，炎中歲癥微環(huán)境也影響著腫瘤的起始和進(jìn)展。癌細(xì)胞周圍的免疫微環(huán)境可以識(shí)別和抑制腫瘤生長或促進(jìn)進(jìn)展。在乳腺癌中，高免疫浸潤已與更好的臨床結(jié)果。此外，高免疫浸潤已與新輔助和輔助化療的反應(yīng)增加相關(guān)。
二、材料與方法
1數(shù)據(jù)來源
1）基因表達(dá)：手術(shù)收集的MicMa隊(duì)列（其中的子集用于分析， MicMa-nCounter（n = 96，F(xiàn)FPE），MicMa-Agilent（n=104，新鮮冷凍組織））
2）RNA-seq：OSLO2-EMIT0隊(duì)列（GSE135298，原始數(shù)據(jù)在EGAS00001003631）
3）公開的數(shù)據(jù)：表達(dá)數(shù)據(jù)從GEO、European Genome-phenome Archive、ArrayExpress或TCGA獲得；METABRIC隊(duì)列
2分析流程
1）基因集富集分析
2）無監(jiān)督聚類獲得免疫簇：基于509個(gè)基因，使用R包pheatmap對(duì)患者的相關(guān)性矩陣進(jìn)行層次聚類
3）Nanodissect：用于淋巴和髓細(xì)胞浸潤的預(yù)測，淋巴細(xì)胞或骨髓細(xì)胞浸潤的nanodissect分?jǐn)?shù)反映了樣本中各自基因的平均表達(dá)量
4）CIBERSORT（22種類型的浸潤性免疫細(xì)胞的絕對(duì)比例）、ssGSEA（上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細(xì)胞、增殖和細(xì)胞周期相關(guān)途徑的基因集）
5）二項(xiàng)式邏輯回歸預(yù)測免疫集群：R包glmnet （構(gòu)建模型公式）
6）免疫浸潤的病理評(píng)估
7）ROR評(píng)分：ROR-Score=0.05×Basal+0.12×Her2-enriched???0.34×Luminal A+0.23×Luminal B；其中，基底、Her2富集、管腔A和管腔B是每個(gè)樣本與R中使用genefu包獲得的質(zhì)心的相關(guān)性
8）統(tǒng)計(jì)學(xué)、生存分析、多變量Cox回歸分析
三、結(jié)果展示
01 -乳腺癌的免疫簇并反映了逐漸的免疫浸潤
測量了MicMa隊(duì)列的95個(gè)腫瘤樣本中760個(gè)基因的表達(dá)，該陣列旨在剖析實(shí)體腫瘤中的免疫浸潤。這95個(gè)樣本中的79個(gè)樣本之前已經(jīng)通過Agilent全基因組4×44K寡核陣列進(jìn)行了剖析。首先使用Pearson和Spearman相關(guān)性比較了兩個(gè)獲得的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)值之間存在高度的正相關(guān)（補(bǔ)充圖1A）。
為了根據(jù)免疫相關(guān)基因表達(dá)的相似性對(duì)患者進(jìn)行分組，對(duì)相關(guān)矩陣進(jìn)行了無監(jiān)督的分層聚類（圖1a和補(bǔ)充圖1B）。從3到10個(gè)聚類的輪廓圖分析表明，3個(gè)聚類最好地捕獲了nCounter和Agilent數(shù)據(jù)集的分割（補(bǔ)充圖1C，D）。比較了兩個(gè)數(shù)據(jù)集MicMa-nCounter和MicMa-Agilent的聚類結(jié)果。在這兩個(gè)數(shù)據(jù)集中，有79個(gè)樣本是重疊的。隨著用于測量基因表達(dá)的不同，以及基因列表和用于執(zhí)行無監(jiān)督聚類的樣本的不完全重疊，仍然發(fā)現(xiàn)79個(gè)重疊樣本的聚類分配顯著相似。
為了確認(rèn)集群與腫賣含睜瘤免疫微環(huán)境相關(guān)（圖1b），使用算法Nanodissect為總淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)老橋胞浸潤打分。Nanodissect評(píng)分首先在MicMa隊(duì)列中使用有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家分析的匹配蘇木精和曙紅切片的免疫浸潤評(píng)估進(jìn)行驗(yàn)證（圖1c和補(bǔ)充圖1E）。發(fā)現(xiàn)這三個(gè)簇與Nanodissect淋巴細(xì)胞（圖1b）和骨髓細(xì)胞（補(bǔ)充圖1F）評(píng)分顯著相關(guān)。得出結(jié)論，簇A-C反映了逐漸的免疫浸潤，因此被稱為免疫簇。
使用其他9個(gè)隊(duì)列的表達(dá)數(shù)據(jù)驗(yàn)證了這些簇與淋巴/髓細(xì)胞浸潤之間的關(guān)聯(lián)。有509個(gè)基因在所有研究的數(shù)據(jù)集中被發(fā)現(xiàn)，被用于無監(jiān)督聚類（圖1d和補(bǔ)充圖2A，分別用于METABRIC和TCGA隊(duì)列的聚類）。在每個(gè)隊(duì)列中，所得到的三個(gè)聚類與淋巴和骨髓Nanodissect評(píng)分顯著相關(guān)（圖1e；補(bǔ)充圖2B）。淋巴和髓細(xì)胞浸潤從簇A（藍(lán)色；低浸潤；冷腫瘤）逐漸增加到簇B（淺藍(lán)色；中等浸潤）和簇C（粉紅色；高浸潤；熱腫瘤）。
對(duì)于額外的一層驗(yàn)證，使用METABRIC隊(duì)列中免疫浸潤的病理評(píng)估，這與Nanodissect評(píng)分（圖1f和補(bǔ)充圖2C）和免疫簇顯著相關(guān)。使用PanCancer免疫剖析陣列的基因進(jìn)行無監(jiān)督分層聚類，可以根據(jù)免疫浸潤的漸進(jìn)水平對(duì)乳腺癌腫瘤進(jìn)行分組。
02 -免疫簇與預(yù)后相關(guān)
對(duì)于兩個(gè)最大的隊(duì)列METABRIC(n = 1904)和TCGA(n = 981)，發(fā)現(xiàn)簇B(具有中等水平的免疫浸潤)與更差的預(yù)后相關(guān)(補(bǔ)充圖3A，B)。當(dāng)分別對(duì)ER陰性（補(bǔ)充圖3C，D）和ER陽性（補(bǔ)充圖3E，F(xiàn)）的病例進(jìn)行分層時(shí)，也觀察到簇B病例的這種更差的結(jié)果。為了完善觀察結(jié)果，根據(jù)簇B（淺藍(lán)色）與簇A和簇C（紫色）繪制了患者生存期圖，并證實(shí)簇B患者的預(yù)后明顯且顯著惡化（圖2）。用相關(guān)生存數(shù)據(jù)在另外四個(gè)隊(duì)列中進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。結(jié)論是免疫簇與ER陰性和ER陽性乳腺癌的預(yù)后相關(guān)。
03 - 用二項(xiàng)式邏輯回歸預(yù)測免疫簇
基于免疫聚類的臨床相關(guān)性，旨在開發(fā)一種通用的方法，能夠準(zhǔn)確而敏感地預(yù)測患者的預(yù)后較差的分類，而不必依賴于無監(jiān)督聚類。作者使用二項(xiàng)式邏輯回歸，通過lasso進(jìn)行懲罰，得到一組基因，這些基因可以敏感和特異地預(yù)測一個(gè)樣本是否屬于簇B，通過接收者操作特征曲線和曲線下面積（AUC）分析評(píng)估（圖3a）。96.3%的樣本被模型預(yù)測為簇A和簇C，而68.8%的樣本分到了簇B（圖3b）。
通過比較生存期對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)p值，發(fā)現(xiàn)lasso分類普遍改善了免疫簇與生存期之間的顯著關(guān)聯(lián)。lasso模型在另外5個(gè)隊(duì)列中得到了驗(yàn)證。圖3c-e為STAM(n = 856)、MAINZ(n= 200)和UPSA(n = 289)，補(bǔ)充圖5A、B為CAL(n = 118)和PNC(n= 92)。
由于二項(xiàng)式邏輯回歸只預(yù)測了兩個(gè)簇（簇B與簇A和簇C），進(jìn)行了另一輪二項(xiàng)式邏輯回歸，以高準(zhǔn)確度區(qū)分簇A和簇C（補(bǔ)充圖5C，D）。
04 -免疫簇，一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素
作者進(jìn)一步研究了免疫簇與乳腺癌中著名的臨床病理特征（大小、年齡、等級(jí)、階段、淋巴結(jié)受累和分子亞型（PAM50））的關(guān)系。簇A（免疫浸潤度低）富含ER陽性和Luminal病例，而簇C（免疫浸潤度高）中ER陰性和Basal樣病例比例較高，ER陰性和ER陽性樣本以及PAM50亞型在預(yù)后不良的簇B中同樣占有一定比例（圖4a，b）。
使用多變量Cox回歸分析測試了免疫簇的預(yù)后影響，同時(shí)考慮了其他預(yù)后因素。發(fā)現(xiàn)免疫簇是模型生存的重要因素，如每個(gè)隊(duì)列Cox模型中與免疫群相關(guān)的顯著p值所示。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)免疫簇作為重要的預(yù)后生物標(biāo)志物的優(yōu)勢，采用了逐步回溯選擇的方法。對(duì)于所有隊(duì)列，免疫簇被保留在最佳擬合的最小模型中，在11個(gè)隊(duì)列中的9個(gè)隊(duì)列中，免疫簇是一個(gè)顯著的預(yù)后變量。
05 -具有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（ROR）評(píng)分的新RNA-seq數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證
EMIT0，這是OSLO2隊(duì)列研究的一個(gè)子集，OSLO2-EMIT0由食品和藥物管理局批準(zhǔn)的Prosigna復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（ROR）分?jǐn)?shù)評(píng)估，ROR評(píng)分在標(biāo)準(zhǔn)的臨床病理特征之上增加了重要的預(yù)后信息。發(fā)現(xiàn)簇B組成的樣本與簇A和C相比具有中間的ROR評(píng)分（圖4c），表明與簇B相關(guān)的不良預(yù)后不可能由ROR評(píng)分中包含的信息來解釋。當(dāng)分別評(píng)估ER陰性（補(bǔ)充圖7A）和ER陽性（補(bǔ)充圖7B）病例時(shí)有同樣結(jié)果。對(duì)于所有隊(duì)列通過已有方法計(jì)算ROR評(píng)分，該方法與PAM50亞型有關(guān)，并證實(shí)簇B由中間ROR評(píng)分組成（圖4d和補(bǔ)充圖7C，D）。
多變量回歸分析證實(shí)，免疫簇為ROR評(píng)分帶來了額外的預(yù)后價(jià)值，這體現(xiàn)在用ROR評(píng)分和免疫簇建立生存模型時(shí)，免疫簇的p值顯著。通過計(jì)算凈重分類改善（NRI）和綜合判別改善（IDI）指數(shù)，強(qiáng)調(diào)了免疫簇與ROR評(píng)分一起使用時(shí)，根據(jù)生存率對(duì)患者進(jìn)行分類的額外價(jià)值，正如所有隊(duì)列中NRI和IDI系數(shù)為正值所示。NRI和IDI的置信區(qū)間（CI）構(gòu)建的Bootstrapping顯示，對(duì)于幾個(gè)隊(duì)列，免疫簇與ROR評(píng)分相加時(shí)，顯著改善了患者根據(jù)預(yù)后的分類。
06 - 免疫簇和對(duì)新輔助化療的反應(yīng)
進(jìn)一步評(píng)估了免疫簇與新輔助化療反應(yīng)之間的關(guān)系，使用了來自8項(xiàng)研究（1377個(gè)樣本）的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并使用lasso將每個(gè)樣本分配給其所屬的免疫簇。如圖4e，發(fā)現(xiàn)簇C應(yīng)答者百分比最高，其次是簇A，簇B應(yīng)答者百分比最低。還計(jì)算了每個(gè)組中應(yīng)答者的百分比：簇C平均有42%的應(yīng)答者和58%的殘余疾病患者，而簇B有18%/82%的應(yīng)答者和13%/87%的殘余疾病患者。由于pCR率作為ER狀態(tài)的函數(shù)不同，還獨(dú)立計(jì)算了ER陽性和ER陰性病例的應(yīng)答者比例，發(fā)現(xiàn)無論ER狀態(tài)如何，簇B的應(yīng)答者比例最低（分別為補(bǔ)充圖8A、B）。
對(duì)于每個(gè)對(duì)新輔助化療有反應(yīng)的隊(duì)列，評(píng)估了pCR和非pCR病例在各免疫群中的分布。當(dāng)考慮整個(gè)隊(duì)列時(shí)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)答者在各免疫群組的分布有顯著不同，簇B的應(yīng)答者較少，簇C組的應(yīng)答者居多；當(dāng)按ER狀態(tài)拆分時(shí)，雖然并非總是顯著，但也觀察到同樣的趨勢。這些結(jié)果表明，簇C中的患者有更高的概率成為應(yīng)答者。研究結(jié)果還突出了簇B的低響應(yīng)率，表明這類患者可能是新的新輔助治療方案測試的候選人。
07 - 免疫簇的計(jì)算機(jī)剖析
為了評(píng)估集群中的逐漸免疫浸潤是否可以解釋與預(yù)后的關(guān)聯(lián)，在Cox多變量回歸分析中測試了免疫集群或總免疫浸潤評(píng)分中哪一個(gè)對(duì)生存更有預(yù)測性。作者假設(shè)特定的免疫細(xì)胞類型混合物，而不是腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞總數(shù)，可能是簇B預(yù)后差的原因。
使用CIBERSORT算法估計(jì)22種不同的免疫細(xì)胞類型的比例，對(duì)這種細(xì)胞類型特異性中位數(shù)浸潤分?jǐn)?shù)進(jìn)行無監(jiān)督聚類（圖5a）。簇C病例中，富集了巨噬細(xì)胞M1、記憶激活T細(xì)胞和濾泡T輔助細(xì)胞（圖5a），METABRIC和TCGA隊(duì)列中CIBERSORT評(píng)分的分布也說明了這一點(diǎn)（圖5b）。簇A如預(yù)期的那樣，免疫細(xì)胞的水平非常低。在反應(yīng)和預(yù)后較差的簇B中，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞M2、靜止肥大細(xì)胞和靜止記憶T細(xì)胞的水平較高（圖5a，圖5b）。
使用廣義線性模型，指定了區(qū)分簇B與簇A-C的免疫細(xì)胞類型（圖5c）。還測試了哪些免疫細(xì)胞類型解釋了簇A與簇B之間的差異和簇B與簇C之間的差異。
08 - 免疫簇的表型分析
通過差異基因表達(dá)分析確定了簇B中顯著過度表達(dá)的基因，與簇A和簇C相比，簇B中有909個(gè)基因分別上調(diào)。這些基因與干細(xì)胞生物學(xué)和EMT相關(guān)，如使用MsigDB31的H和C2集合的基因集富集分析（GSEA）所示（圖6a）。
為了進(jìn)一步描述免疫簇與癌細(xì)胞表型之間的關(guān)系，使用了與EMT、干細(xì)胞、缺氧和增殖相關(guān)的基因集。使用GSVA方法計(jì)算了每個(gè)集群和隊(duì)列的平均基因集富集分?jǐn)?shù)，該分?jǐn)?shù)反映了免疫集群中每個(gè)路徑/基因集的活動(dòng)。平均基因集分?jǐn)?shù)的無監(jiān)督聚類將免疫簇A和C分開，而簇B被分為兩個(gè)亞組（圖6b）。這些結(jié)果表明免疫簇與干細(xì)胞/EMT相關(guān)基因特征之間存在關(guān)聯(lián)。
通過GSVA富集分?jǐn)?shù)的無監(jiān)督聚類，確定了乳腺癌中兩個(gè)相互排斥的基因特征：（i）一個(gè)與增殖和胚胎干細(xì)胞樣表型相關(guān)，（ii）另一個(gè)與EMT和乳腺干細(xì)胞表型相關(guān)。增殖表型在簇C中占主導(dǎo)地位（補(bǔ)充圖11A），當(dāng)計(jì)算每個(gè)代謝樣品的基因集得分時(shí)也觀察到了同樣的情況（補(bǔ)充圖11B）。在簇B中，EMT或增殖相關(guān)特征的平均基因集得分較高（補(bǔ)充圖11C）。在代謝物組的樣品水平上，我們觀察到一個(gè)或另一個(gè)狀態(tài)被激活的樣品的類似模式（補(bǔ)充圖11D）。簇A顯示EMT和增殖狀態(tài)得分較低（補(bǔ)充圖11E，F(xiàn)）。
為了正式確定哪些基因集分?jǐn)?shù)解釋簇B，使用廣義線性模型測試每個(gè)基因集的貢獻(xiàn)程度。EMT標(biāo)志對(duì)簇B有積極貢獻(xiàn)，而增殖和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性與簇A和C相關(guān)（圖6c）。還測試了當(dāng)單獨(dú)與簇A或簇C比較時(shí)，哪種基因集得分可以解釋簇B。
09- 腫瘤表型與免疫浸潤的相關(guān)性
由于免疫簇與（i）免疫細(xì)胞類型和（ii）基因集特征相關(guān)，評(píng)估了免疫浸潤（CIBERSORT）和癌細(xì)胞特征（基因集分?jǐn)?shù)）之間的關(guān)系。圖6d顯示增殖和EMT分?jǐn)?shù)與不同類型的免疫細(xì)胞顯著相關(guān)。高EMT分?jǐn)?shù)與巨噬細(xì)胞M2、靜息肥大細(xì)胞和靜息記憶T細(xì)胞相關(guān)，而高增殖與更活躍的適應(yīng)性腫瘤微環(huán)境相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明癌細(xì)胞表型和腫瘤微環(huán)境的組成之間存在連續(xù)性。
簇B以致瘤免疫浸潤為主，EMT信號(hào)高，但約35%的簇B也表現(xiàn)為增殖表型。為了探索簇B中的這種異質(zhì)性，以無監(jiān)督的方式根據(jù)基因特征分?jǐn)?shù)將樣本分組為B1以EMT表型為主，B2以增殖為主（圖6e）。
在METABRIC和TCGA中，具有增殖表型的B2病例的預(yù)后較差（圖6f，g）。為了進(jìn)一步評(píng)估基因集評(píng)分的異質(zhì)性是否伴隨著免疫環(huán)境的異質(zhì)性，作者尋求B1和B2亞群之間特異性免疫細(xì)胞類型的差異。補(bǔ)充圖14中的無監(jiān)督聚類顯示，兩個(gè)子聚類B1和B2都具有促腫瘤/靜息免疫微環(huán)境?？偠灾?，簇B中兩種相互排斥的狀態(tài)可能與預(yù)后有關(guān)；然而，簇B的一個(gè)統(tǒng)一因素是存在促腫瘤/靜息免疫微環(huán)境。
四、結(jié)論
在本研究中，發(fā)現(xiàn)了與臨床相關(guān)的免疫簇與漸進(jìn)性免疫浸潤。在15個(gè)乳腺癌隊(duì)列中，跨越6101個(gè)乳腺癌樣本，腫瘤免疫浸潤中等水平的患者群預(yù)后較差，與已知的預(yù)后分子和臨床病理學(xué)特征無關(guān)。通過對(duì)群組免疫成分的表征，發(fā)現(xiàn)親腫瘤免疫浸潤與不良預(yù)后組相關(guān)。進(jìn)一步的表型分析顯示乳腺癌中存在兩種相互排斥的侵襲性腫瘤表型，一種與EMT有關(guān)，另一種與增殖有關(guān)。這兩種表型都是在不活躍/促腫瘤免疫微環(huán)境上發(fā)現(xiàn)的不良預(yù)后群。
